A reação em cadeia da polimerase (PCR, na sigla em inglês) é uma técnica de biologia molecular que permite replicação in vitro do DNA de forma rápida. Essa técnica surgiu na década de 1980 e permitiu avanços científicos em todas as áreas de investigação genômica. A dupla hélice é estabilizada por ligações hidrogênio, duas entre as bases adenina (A) e timina (T) e três entre as bases guanina (G) e citosina (C). Inicialmente, para que o DNA possa ser replicado, a dupla hélice precisa ser totalmente desnaturada (desenrolada) pelo aumento da temperatura, quando são desfeitas as ligações hidrogênio entre as diferentes bases nitrogenadas.
Qual dos segmentos de DNA será o primeiro a desnaturar totalmente durante o aumento da temperatura na reação de PCR?
A Reação em Cadeia da Polimerase, mais conhecida pela sigla PCR (do inglês: Polymerase Chain Reaction) é um procedimento bastante utilizado em biotecnologia.
Por meio da PCR é possível obter grande número de cópias de regiões específicas de DNA, a partir de uma ou algumas poucas moléculas desse ácido nucleico. Dessa forma, a PCR é um processo que permite, em laboratório, amplificar (multiplicar) uma amostra que contenha quantidades mínimas de DNA.
Amostras de DNA encontrados em gotas de sangue, esperma e outras fontes que, a princípio, devido à sua reduzida quantidade, não poderiam ser utilizados em pesquisas científicas, investigações criminais ou na determinação de paternidade, são multiplicados por replicações sucessivas em um aparelho conhecido como termociclador.
O procedimento de PCR depende de uma enzima (uma variedade de DNA polimerase) conhecida como taq-polimerase. Esta enzima foi obtida a partir da bactéria Thermus aquaticus, que habita fontes hidrotermais (fontes de água quente). A taq-polimerase é capaz de realizar sua função (produzir uma cadeia de DNA a partir de um molde) em temperaturas elevadas. Esse aspecto é importante, pois, para duplicar o DNA, é necessário separar as duas cadeias que constituem essa molécula. Em laboratório isso é feito por meio da elevação da temperatura do meio, onde as moléculas se encontram, para valores próximos 95ºC. A maioria das enzimas DNA-polimerase (como a humana, por exemplo) sofre desnaturação nessa temperatura, o que não ocorre com a taq-polimerase.
Para ação da taq-polimerase sobre o fragmento de DNA que se deseja multiplicar (amplificar) é necessária uma pequena cadeia simples de DNA conhecida como primer (iniciador). Esta cadeia emparelha-se, por complementaridade de bases, ao fragmento de DNA a ser amplificado e serve como ponto de início para a ação replicadora da taq-polimerase.
A técnica da PCR segue os passos enumerados a seguir:
1. A solução contendo os fragmentos de DNA que serão amplificados é colocada no termociclador juntamente com os primers, com a enzima taq-polimerase, Mg+2 (cofator necessário à atividade da taq-polimerase) e com os nucleotídeos livres.
2. Aumenta-se a temperatura da solução para, aproximadamente, 94ºC. Isto faz com que as duas cadeias do DNA se separem, uma vez que a temperatura elevada desfaz as ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas. Essa etapa se denomina desnaturação.
3. A seguir a temperatura é reduzida para 50ºC, permitindo que os primers se pareiem às cadeias previamente separadas. Essa etapa de pareamento dos primers com os fragmentos de DNA recebe o nome de anelamento.
4. Após o anelamento, tem início a etapa de extensão ou polimerização, na qual a temperatura da solução contida no termociclador é ajustada para 72ºC, ideal para a taq-polimerase,que entra em ação replicando os fragmentos de DNA.
O ciclo, constituído pelas três etapas (desnaturação, anelamento e extensão), é repetido várias vezes. Após cada ciclo, dobra o número de cópias do DNA.
A figura a seguir ilustra os procedimentos envolvidos na realização da PCR.
A temperatura de desnaturação (separação das duas cadeias que constituem uma molécula de DNA) é influenciada pelo pela proporção de pares de bases A/T e G/C presentes na molécula. Entre o par A/T formam-se duas ligações de hidrogênio, enquanto o par G/C estabelece três dessas interações. Portanto, uma molécula de DNA com predominância de pares G/C possuirá maior número de ligações de hidrogênio unindo suas cadeias do que aquela com maior proporção de pares A/T. Para entender esse fato, considere duas moléculas de DNA denominadas X e Y. Ambas possuem 100 nucleotídeos em cada uma de suas cadeias, entretanto, a molécula X contém apenas nucleotídeos de adenina e nucleotídeos com timina. Já Y é possui exclusivamente nucleotídeos com citosina e com guanina.
Sendo assim, X exibe apenas pares A/T (pois é constituída apenas por nucleotídeos de adenina e timina). Como possui 100 nucleotídeos em cada cadeia, X apresenta, então, 100 pares A/T. Como cada par A/T forma duas ligações de hidrogênio, a molécula X possui, por isso, 200 ligações de hidrogênio.
A molécula Y possui apenas pares C/G (já que possui apenas nucleotídeos com guanina e com citosina). Por ser constituída por 100 nucleotídeos em cada uma de suas cadeias, a molécula Y possui 100 pares G/C. Uma vez que par G/C forma três ligações de hidrogênio, a molécula Y exibirá, então, 300 ligações de hidrogênio unindo suas cadeias.
Portanto, duas moléculas (X e Y), de mesmo tamanho (100 nucleotídeos em cada cadeia), exibem quantidades diferentes de ligações de hidrogênio: molécula X com 200 ligações e molécula Y com 300. A temperatura necessária para desnaturar a molécula Y será mais alta do que aquela necessária para fazer o mesmo com a molécula X. Isso ocorre porque a quantidade de ligações de hidrogênio presentes na molécula Y é maior do que na molécula X.
Essa é a lógica a ser aplicada para encontrarmos a resposta da questão proposta. É necessário identificar, dentre os segmentos de DNA apresentados nas alternativas, aquele que vai se desnaturar primeiro durante o aumento da temperatura na primeira etapa da PCR. Todos os segmentos apresentados possuem o mesmo tamanho, ou seja, o mesmo número de pares de bases nitrogenadas. O segmento que exibir menor número de ligações de hidrogênio, por possuir predominância de pares A/T, irá se desnaturar primeiro durante a elevação da temperatura no início de cada ciclo da PCR.
A seguir os segmentos de DNA com seus respectivos números de ligações de hidrogênio.
O segmento de DNA que irá sofrer desnaturação primeiro (por possuir menor número de ligações de hidrogênio) está na alternativa C.
O DNA com mais A/T desnatura primeiro. Mas você não precisa esperar alta temperatura para compartilhar este post. Assine o blog e dissemine conhecimento com eficiência enzimática.
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