Tag: bandas de DNA

O uso de enzimas de restrição e da eletroforese em gel para análise de fragmentos de DNA é um dos temas mais importantes da Biotecnologia contemporânea e, consequentemente para o ENEM. Essas técnicas permitem identificar padrões genéticos, analisar perfis de fragmentação e determinar relações de parentesco com precisão. A resolução a seguir mostra como interpretar bandas em um gel de eletroforese para identificar o pai biológico de uma criança, integrando conceitos essenciais de genética molecular, reconhecimento de sítios de clivagem e herança cromossômica.

Para verificar a eficácia do teste de DNA na determinação de paternidade, cinco voluntários, dentre eles o pai biológico de um garoto, cederam amostras biológicas para a realização deste teste.

A figura mostra o resultado obtido após a identificação dos fragmentos de DNA de cada um deles.

Após a análise das bandas de DNA, pode-se concluir que o pai biológico do garoto é o

A) 1º voluntário.

B) 2º voluntário.

C) 3º voluntário.

D) 4º voluntário.

E) 5º voluntário.

Em 1970 foram descobertas enzimas bacterianas capazes de clivar (= cortar) a molécula de DNA em regiões que apresentam determinadas sequências de nucleotídeos denominadas sítios de clivagem (ou de restrição). Tais enzimas constituem um sistema de proteção das bactérias contra os vírus bacteriófagos. Quando o DNA de um bacteriófago é inoculado em uma bactéria, caso essas moléculas contenham sítios de clivagem, serão cortadas em fragmentos, o que impedirá a multiplicação do vírus.

Essas verdadeiras “tesouras moleculares” receberam a denominação de enzimas de restrição ou endonucleases de restrição e cada uma delas exibe um sitio de clivagem específico. Apesar de cada enzima de restrição clivar o DNA em um sítio de clivagem diferente, esses locais de corte têm em comum o fato de que suas sequências de bases nitrogenadas constituem palíndromos.

Palíndromo é um fenômeno linguístico em que uma palavra ou frase pode ser lida da esquerda para a direita e vice-versa, sem perder o sentido (tente ler a seguinte frase da direita para a esquerda: “Socorram-me, subi no ônibus em Marrocos“). No caso dos sítios de clivagem na molécula de DNA, a sequência de bases nitrogenadas em uma cadeia é o inverso da cadeia complementar.

A figura abaixo ilustra o sítio de clivagem da enzima de restrição conhecida como EcoRI (o nome Eco se refere ao fato de que essa enzima foi isolada a partir da bactéria Escherichia coli).

O sítio de clivagem exibe a região de palíndromo (ou palindrômica), na qual a sequência de uma das cadeias (GAATTC, no caso da enzima EcoRI) é o inverso daquela da cadeia complementar (CTTAAG). Sempre que a enzima encontrar tais sequências no DNA, irá clivar (isto é, cortar) essa molécula da forma indicada na figura a seguir.

Como resultado da clivagem (= corte) são produzidos dois fragmentos que, antes constituíam uma única molécula de DNA, conforme ilustrado na figura seguinte.

Moléculas de DNA podem ter milhares de pares de bases DNA e, por isso, existem vários sítios de clivagem em uma mesma molécula. Sendo assim, quando exposta a determinada enzima de restrição, uma molécula de DNA poderá gerar fragmentos com tamanhos variados.

Considere, agora, a seguinte situação: moléculas de DNA extraídas de uma criança e de cada um de seus pais, foram expostas ao mesmo tipo de enzima de restrição (a EcoRI, por exemplo). A enzima irá irá cortar as moléculas sempre que encontrar seu sítio de clivagem e, como consequência, produzirá fragmentos variados.

Vamos analisar a situação relativa aos pais. Como, neles, as moléculas de DNA têm sequências de bases diferentes, muitos sítios de clivagem estarão localizados em pontos distintos dessas moléculas. Sendo assim, dentre os fragmentos gerados, vários possuirão tamanhos diferentes.

Já a criança, por ter recebido metade de sua informação genética da mãe e, evidentemente, a outra metade do pai, exibirá fragmentos com tamanhos iguais aos da mãe e com tamanhos iguais aos do pai. Sendo assim, todos os fragmentos de DNA da criança, cujos tamanhos não forem iguais aos do DNA materno, exibirão tamanhos iguais aos do DNA paterno.

Logo após a exposição das amostras de DNA à enzima de restrição, é necessário separar os fragmentos de acordo com seus respectivos tamanhos. Para isso utiliza-se um procedimento denominado eletroforese.

Nesse procedimento, a mistura de fragmentos de DNA é colocada em um gel (constituído por agarose ou poliacrilamida) situado em um recipiente (denominado cuba) contendo certa solução química. Devido ao pH dessa solução, as moléculas de DNA exibirão carga elétrica negativa.

Eletrodos de uma fonte de energia são conectados às extremidades da cuba. O eletrodo negativo é ligado a uma extremidade e o positivo à outra. A fonte de energia permanecerá ligada por certo tempo e, ao longo desse período, por estarem negativamente carregados, os fragmentos de DNA se deslocarão através do gel, da extremidade onde se situa o eletrodo negativo para aquela onde se encontra o eletrodo positivo.

Fragmentos de mesmo tamanho deslocam-se pela mesma distância no gel, sendo que os menores alcançam maiores distâncias, pois se movimentam mais facilmente pelos poros existentes no gel.

Na figura acima, podemos observar que a amostra de DNA retirada de um indivíduo é colocada em um local específico (poço) existente no gel. O gel está no interior de uma cuba (não representada) contendo certa solução química. O poço encontra-se na extremidade correspondente ao polo negativo.

Como visto, por exibirem carga negativa, os fragmentos presentes na amostra irão se deslocar ao longo do gel, em direção ao polo positivo. Após tempo suficiente, no gel serão visualizadas bandas (I – VII). Cada banda contém fragmentos de DNA de mesmo tamanho (e que, por isso, se deslocaram pela mesma distância a partir do poço). É importante compreender que uma banda não é apenas um fragmento, mas um conjunto de fragmentos de mesmo tamanho.

Fragmentos menores por se movimentarem mais facilmente pelos poros do gel, deslocam-se mais do que os fragmentos de maior tamanho. Desta forma, as bandas que se situam mais distantes da origem (poço) contêm fragmentos de menor tamanho. Da mesma forma, as bandas localizadas nas proximidades da origem são as que contêm fragmentos de maior tamanho. Então, na figura, podemos afirmar que a ordem crescente de algarismos romanos corresponde à uma ordem decrescente de tamanhos de fragmentos que formam as bandas.

Agora, vamos aplicar esse conhecimento para analisar os fragmentos de DNA da criança e de seus pais.

Na figura a seguir estão representados os sítios de clivagem nas moléculas de DNA do casal e do filho, bem como os fragmentos resultantes do tratamento dessas amostras de DNA com uma enzima de restrição.

Suponha que, se organizarmos os fragmentos representados na figura acima em ordem decrescente de tamanho, tenhamos a seguinte sequência: c, b, h, e, f, i, a, g, d. Isso significa que o fragmento c, por ser o maior, se desloque menos que os demais no gel de eletroforese. Da mesma forma, o fragmento d, sendo o menor, se desloque por maior distância. Então teríamos a situação apresentada na figura a seguir.

Como visto anteriormente, a criança possui DNA de origem materna e paterna. Dessa forma, exibirá fragmentos cujos tamanhos são iguais a aqueles observados na mãe ou no pai. Então, a eletroforese dos fragmentos de DNA da criança produzirá bandas similares a aquelas da mãe ou as do pai, ou seja, as bandas da criança sem equivalência naquelas encontradas na mãe deverão ser equivalentes as do pai.

Essa é a lógica considerada quando é necessário avaliar entre dois ou mais indivíduos qual é o pai biológico de uma criança. Todas as bandas não maternas presentes na criança serão encontradas no pai biológico.  

Para identificarmos o pai biológico da criança dentre os cinco voluntários que forneceram amostras de DNA para a eletroforese, devemos buscar aquele que apresenta todas as bandas não maternas observadas no garoto.

Como a criança recebe metade de seu DNA cromossômico da mãe e a outra metade do pai, todos os fragmentos de DNA que não forem provenientes da mãe, são obrigatoriamente provenientes do pai biológico.

Analisando o DNA dos cinco voluntários, verificamos que o 4º é o único que atende esse requisito. Portanto, o 4º voluntário é o pai biológico da criança.

Na figura abaixo, os fragmentos de DNA compartilhados entre a criança e cada um dos genitores estão destacados.